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실험 설계 화면에서는 Clostridium novyi가

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실험 설계 화면에서는 Clostridium novyi가

커뮤니케이션 생물학 볼륨

커뮤니케이션 생물학 6권, 기사 번호: 118(2023) 이 기사 인용

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클로스트리듐 노비-NT(Clostridium novyi-NT)는 저산소 종양 내에서 발아하여 암세포를 죽이는 항암 박테리아 치료제이지만, 씨. 노비-NT의 실제 발아 유발 요인은 아직 알려져 있지 않습니다. 이 연구에서 우리는 조합 실험 설계를 사용하여 후보 발아체를 스크리닝하고 D-발린이 4.2mM 농도에서 50% 포자 발아를 유도하는 강력한 발아체라는 사실을 우연히 발견했습니다. 추가 조사에 따르면 5개의 D-발린 유사체도 발아 세포이고 이들 유사체 중 4개는 거울상 이성질체 쌍인 것으로 나타났습니다. L- 및 D-아미노산의 이러한 입체 유연성 효과는 포자 발아가 거울상 이성질체 상호작용이 혼란스러울 수 있는 복잡한 과정임을 보여줍니다. 이 연구에서는 또한 L-시스테인을 발아체로 확인하고, 하이포잔틴과 이노신을 공동 발아체로 식별합니다. 몇몇 다른 아미노산은 상호작용 의존 방식으로 발아를 촉진(L-발린, L-히스티딘, L-트레오닌 및 L-알라닌)하거나 억제(L-아르기닌, L-글리신, L-리신, L-트립토판)합니다. D-알라닌은 복잡한 성장 배지에서도 모든 발아를 억제합니다. 이 연구는 종양에서 씨. 노비-NT 포자의 발아 효능을 개선하기 위한 기반을 마련합니다.

Clostridium novyi A형은 절대혐기성 포자형성세균으로 양, 염소, 돼지에서 클로스트리듐 근괴사증, 큰 머리, 괴사성 간염을 유발합니다1. 특히, 이는 숫양의 'Dikkop' 부푼 머리(Swollen Head)의 원인이 되며, 싸울 때 어린 숫양 사이에 가해진 상처를 통해 발생하는 감염이며, 48~72시간 내에 사망합니다. 씨. 노비(C. novyi)는 헤로인이 씨. 노비 포자3에 오염된 스코틀랜드의 마약 사용자들 사이에서 산발적으로 감염이 발생하는 것을 제외하고 인간보다 소에서 더 병원균입니다3.

알파 독소의 약독화를 통해 생성된 야생형 박테리아의 치명적이지 않은 버전인 C. novyi-NT는 현재 고형 종양에 대한 실험적 치료법으로 임상 테스트 중입니다4,5. C. novyi-NT의 치료 잠재력은 종양의 저산소 영역(<0.5% 산소)을 선택적으로 군집화하고 국소적인 세포독성 효과를 발휘하는 능력에서 비롯됩니다6. 씨. 노비-NT 이전의 다른 클로스트리디아가 종양 살해 효과에 대해 조사되었지만, 씨. 노비-NT는 영양 막대 대신 포자로 투여된 최초의 사례입니다4. 상대적으로 비면역원성인 것 외에도 씨. 노비-NT를 포자로 투여하면 저산소 종양 미세환경 내에서 발아가 선호되기 때문에 종양 특이성의 추가 층이 추가됩니다4,6. 휴면 중인 포자는 산소에 대한 저항력도 있으며 그렇지 않으면 식물 형태의 포자를 죽일 수 있습니다6. 따라서 포자는 종양 치료를 위한 이상적인 클로스트리듐 형태이지만, 환원 환경에 대한 요구 사항 외에 씨. 노비-NT 포자를 발아시키는 요인에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 또한, C. novyi-NT가 일부 종양에서는 효과적인 집락 형성자가 되지만 다른 종양에서는 그렇지 않은 이유가 미스터리로 남아 있습니다7.

박테리아 포자와 발아에 대한 우리의 현재 지식은 주로 Bacillus 및 Clostridium 속을 기반으로 합니다8,9. 본질적으로 박테리아는 대사 자원이 부족할 때 포자 형성되지만 자원이 풍부한 조건이 다시 우세할 때 발아합니다. 휴면 상태에서 유리한 조건이 돌아올 때까지 참을성 있게 기다리는 능력은 포자 형성 박테리아의 생존 이점을 요약합니다. 병원성 박테리아에서 이 순환 과정은 일단 양성 포자가 표적 환경을 감염시키고 독소를 생성하는 영양 형태로 발아하기 때문에 병인을 유발합니다10,11,12. 발아는 두 단계로 나눌 수 있습니다13. 첫 번째 단계는 발아 수용체(GR)라고 불리는 특정 단백질과 소분자 영양 발아체의 상호작용으로 시작됩니다. GR 활성화는 1가 양이온(H+, K+ 및 Na+)과 칼슘 디피콜리네이트(CaDPA)의 방출뿐만 아니라 포자 코어의 부분적인 수화를 유발합니다. 두 번째 단계에서는 포자 피질 층이 가수분해되어 핵이 확장되고 완전한 수화가 이루어지며 휴면 상태에서 전환이 완료됩니다. 결과적으로 DNA, 단백질 합성 및 주요 대사 경로가 활성화되어 영양 형태가 성장하게 됩니다14.

5). Once this number was filtered to the key pro-germinants, a full factorial design (Supplementary Table 2) was then used to analyze any interactions amongst them. In all experiments, germination was measured by the drop in OD600 over time. All germination positive readings were verified by loss of refractility under phase contrast microscopy. High non-physiological concentrations were first used in the germinant screens to minimize false negatives. Dose response studies were subsequently used to study the screened germinants at physiological concentrations. In this study, all germinant candidates are cataloged in Supplementary Table 3, technical terms used in the DOE graphs are defined in Supplementary Table 4, and all statistical tests performed are listed in Supplementary Table 5./p>10% (green) were identified as germinants. Significant at ****p ≤ 0.0001,***p ≤ 0.001,**p ≤ 0.01,*p ≤ 0.05, ns p > 0.05 (unpaired t-test) when compared to 4-aminobutyric acid. b Germination response of valine analogs (91.5 mM) L-2-aminobutyric acid (orange circles), D-2-aminobutyric acid (pink circles), L-norvaline (dark green circles), D-norvaline (purple circles), S-(3)-aminobutyric acid (gray circles) in the presence of the inhibitors D-cysteine and D-alanine (91.5 mM concentration). Significant at ****p ≤ 0.0001,***p ≤ 0.001,**p ≤ 0.01,*p ≤ 0.05, ns p > 0.05 (unpaired t-test) when compared to corresponding water controls. c Dose response curve for germination response at different concentrations of L-2-aminobutyric acid (orange), D-norvaline (purple) and L-cysteine (green) (normalized to germination with D-valine at the highest concentration 91.5 mM) shows potency of valine analogs similar to L-cysteine. Circles depict individual values. Solid lines depict the least squares fit regression curve. Shaded area shows the 95% confidence error bands for each amino acid fit. EC50 values are shown in the legend. d Proposed two-component signaling framework for C. novyi-NT germination. All germination data depict mean ± SD, n = 4 biologically independent samples. Germination % for all graphs are defined in Supplementary Table 4./p>99% phase bright spores. The spore concentration was adjusted to 5 × 109 CFU/ml by appropriate dilution in 1× PBS using a standard curve correlating OD600 absorbance to cell count./p>

3.0.CO;2-8" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F%28SICI%291097-0215%2819960904%2967%3A5%3C661%3A%3AAID-IJC12%3E3.0.CO%3B2-8" aria-label="Article reference 58" data-doi="10.1002/(SICI)1097-0215(19960904)67:53.0.CO;2-8"Article CAS Google Scholar /p>